細菌のシチジンデアミナーゼ毒素により、CRISPRフリーのミトコンドリア塩基編集が可能

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A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing

BY Mok, MH de Moraes, J Zeng, DE Bosch, AV Kotrys… - Nature, 2020 - nature.com

… double-strand breaks, a capability that has the potential to model mitochondrial disease
mutations, correct pathogenic variants (Supplementary Table 10) and expand our knowledge of …

• A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing

  Abstract
  Bacterial toxins represent a vast reservoir of biochemical diversity that can be repurposed for biomedical applications. Such proteins include a group of predicted interbacterial toxins of the deaminase superfamily, members of which have found application in gene-editing techniques. Because previously described cytidine deaminases operate on single-stranded nucleic acids, their use in base editing requires the unwinding of double-stranded DNA (dsDNA)—for example by a CRISPR–Cas9 system. Base editing within mitochondrial DNA (mtDNA), however, has thus far been hindered by challenges associated with the delivery of guide RNA into the mitochondria. As a consequence, manipulation of mtDNA to date has been limited to the targeted destruction of the mitochondrial genome by designer nucleases.Here we describe an interbacterial toxin, which we name DddA, that catalyses the deamination of cytidines within dsDNA. We engineered split-DddA halves that are non-toxic and inactive until brought together on target DNA by adjacently bound programmable DNA-binding proteins. Fusions of the split-DddA halves, transcription activator-like effector array proteins, and a uracil glycosylase inhibitor resulted in RNA-free DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs) that catalyse C•G-to-T•A conversions in human mtDNA with high target specificity and product purity. We used DdCBEs to model a disease-associated mtDNA mutation in human cells, resulting in changes in respiration rates and oxidative phosphorylation. CRISPR-free DdCBEs enable the precise manipulation of mtDNA, rather than the elimination of mtDNA copies that results from its cleavage by targeted nucleases, with broad implications for the study and potential treatment of mitochondrial disorders.

• 細菌のシチジンデアミナーゼ毒素により、CRISPRフリーのミトコンドリア塩基編集が可能

  概要
  細菌毒素は、生物医学的用途に再利用できる生化学的多様性の広大な貯水池を表しています。 このようなタンパク質には、デアミナーゼ スーパーファミリーの予測された細菌間毒素のグループが含まれており、そのメンバーは遺伝子編集技術への応用が見出されています。 前述のシチジン デアミナーゼは一本鎖核酸に作用するため、塩基編集に使用するには、CRISPR-Cas9 システムなどによる二本鎖 DNA (dsDNA) の巻き戻しが必要です。 しかし、ミトコンドリア DNA (mtDNA) 内の塩基編集は、これまでガイド RNA のミトコンドリアへの送達に関連する課題によって妨げられてきました。 結果として、これまでの mtDNA の操作は、デザイナー ヌクレアーゼによるミトコンドリア ゲノムの標的破壊に限定されていました。 隣接して結合したプログラム可能な DNA 結合タンパク質によってターゲット DNA に結合されるまで、非毒性で不活性なスプリット DddA 半分を設計しました。 スプリットDddA半分、転写活性化因子様エフェクターアレイタンパク質、およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤の融合により、ヒトmtDNAのC・GからT・Aへの変換を触媒する、RNAを含まないDddA由来のシトシン塩基エディター（DdCBE）が得られました 高い標的特異性と製品純度を備えています。 DdCBE を使用して、ヒト細胞における疾患関連の mtDNA 変異をモデル化し、呼吸速度と酸化的リン酸化の変化をもたらしました。 CRISPR フリーの DdCBE は、標的ヌクレアーゼによる mtDNA の切断に起因する mtDNA コピーの除去ではなく、mtDNA の正確な操作を可能にし、ミトコンドリア障害の研究と潜在的な治療に幅広い意味を持ちます。

 

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